La cloroquina 96

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Afiliación: Departamento de Patología de la Universidad de Oklahoma Health Sciences Center, de Oklahoma City, Oklahoma, Estados Unidos de América Resumen La cloroquina es un agente antipalúdico establecida que ha sido probado recientemente en ensayos clínicos para su actividad contra el cáncer. El efecto favorable de la cloroquina parece ser debido a su capacidad de sensibilizar a las células cancerosas a la quimioterapia, la radioterapia, e inducir la apoptosis. El presente estudio investigó la interacción de iones de zinc con cloroquina en una línea celular de cáncer de ovario humano (A2780). La cloroquina mejora la absorción de zinc por las células A2780 en una manera dependiente de la concentración, como se ensayó utilizando una sonda de zinc fluorescente. Esta mejora fue atenuada por TPEN, un compuesto de alta afinidad de metal de unión, lo que indica la especificidad de la absorción de zinc. Además, la adición de iones de cobre o de hierro no tuvo ningún efecto sobre la absorción de zinc cloroquina inducida. examen microscópico fluorescente de la distribución intracelular de zinc demostró que los iones de cinc libres son más concentrado en los lisosomas después de la adición de la cloroquina, que es coherente con los informes anteriores que muestran que la cloroquina inhibe la función lisosoma. La combinación de cloroquina con zinc mejorado chloroquines la citotoxicidad y la apoptosis inducida en células A2780. Por lo tanto la cloroquina es un ionóforo de zinc, una propiedad que puede contribuir a chloroquines actividad anticancerígena. Cita: Xue J, Moyer A, B Peng, Wu J, Hannafon BN, Ding W-Q (2014) La cloroquina es un ionóforo de zinc. PLoS ONE 9 (10): e109180. doi: 10.1371 / journal. pone.0109180 Editor: Yuan-Soon Ho, de la Universidad de Medicina de Taipei, Taiwán recibidos: June 25, 2014 Aceptado: Septiembre 10, 2014 Publicado: 1 de octubre 2014 Copyright: 2014 Xue et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons. que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan. Disponibilidad de datos: Los autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel. Financiación: Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Sociedad Americana del Cáncer (CNE-117557) Susan G. Komen for the Cure Foundation (KG081083) el programa NIH OK-INBRE (3P20RR016478-09S2) y el Centro para el Avance de Oklahoma de Ciencia y Tecnología (HR09-025). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia. Introducción La cloroquina es un fármaco antimalárico que se ha utilizado en los seres humanos durante muchos años 1. En los últimos años, la cloroquina ha sido demostrado que inhibe la autofagia e inducir la apoptosis en las células malignas y por lo tanto se ha probado en varios sistemas de modelo experimental 2 y en ensayos clínicos humanos 3. 4. Los estudios han demostrado que la cloroquina sensibiliza las células tumorales a la radioterapia o la quimioterapia 5 6 8. por lo tanto, la cloroquina puede potencialmente ser un fármaco eficaz contra el cáncer en oncología clínica. También se ha demostrado que la cloroquina sensibiliza a las células de cáncer de mama a la quimioterapia independiente de la inhibición de la autofagia 9. y los efectos secundarios potenciales de la terapia cloroquina también han sido cuidadosamente discutido 10. 11. Esto indica que se requiere una comprensión más detallada de mecanismo chloroquines contra el cáncer en fin de seguir desarrollando este compuesto en un agente eficaz contra el cáncer. La cloroquina ejerce un efecto pleiotrópico en las células eucariotas, incluyendo una elevación de pH vacuolar cuando atrapado en orgánulos ácidos, tales como lisosomas. Este aumento de pH interrumpe la acidificación lisosomal que lleva al deterioro de la fusión y la degradación autophagosome autophagic 12. 13. A nivel molecular, la cloroquina ha sido demostrado que actúa sinérgicamente con un inhibidor de Akt para inducir la muerte de células tumorales 14. Sin embargo, nuestra comprensión de chloroquines la acción a nivel celular y molecular en las células cancerosas es bastante limitado. Hemos informado anteriormente de que la actividad contra el cáncer iones de zinc exposición mediante la alteración de lisosoma permeabilidad de la membrana 15 y a través de la regulación de la expresión génica 16. Zinc compuestos, especialmente los ionóforos de cinc, de unión son un nuevo grupo de agentes anticancerígenos potenciales que se dirigen zinc a los lisosomas e inducen lisosoma mediada apoptosis de las células cancerosas 17. Además, el papel de zinc en la regulación de la autofagia ha sido recientemente realizado 18. Considerando que estudios previos han encontrado que el metal que contiene complejos de cloroquina puede conducir a una mayor actividad antimalárica 19. su interacción con los iones de zinc nunca ha sido investigado en cualquier sistema biológico. Dada la actividad contra el cáncer informado de iones de zinc y la cloroquina y su participación en funciones lisosomales, hemos tratado de investigar si los iones de zinc interactúan con cloroquina y si esta interacción altera la actividad anticancerígena chloroquines. Nos informan de que la cloroquina es un ionóforo de zinc, que se dirige a los lisosomas de zinc, y que la combinación de zinc y cloroquina mejora su citotoxicidad e induce la apoptosis en un sistema modelo de células de cáncer humano. Materiales y Métodos Materiales El anticuerpo para la caspasa-3 fue de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). El anticuerpo LC3B-II era de Stressgen (Ann Arbor, MI). El anticuerpo PARP era de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). La sonda AM FluoZin-3 y la sonda LysoTracker se adquirieron de Life Technologies Co. (Carlsbad, CA). CellTiter 96 Aqueous Solution (ensayo de MTS) era de Promega (Madison, WI). difosfato de cloroquina, cloruro de zinc, cloruro cúprico, cloruro de hierro, N, N, N, N-tetrakis (2-piridilmetil) etilendiamina (TPEN), Ca-EDTA, el anticuerpo-actina y otros agentes químicos eran de grado analítico y adquirió de Sigma - Aldrich (St. Louis, MO). El cultivo de células A2780 línea celular de carcinoma de ovario humano fue una especie de regalo del Dr. Stephen Howell (Universidad de California, San Diego, CA). células A2780 se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino 10, 100 UI / ml de penicilina, y 100 g / ml de estreptomicina. Las células fueron cultivadas rutinariamente en un medio ambiente humidificado a 37ºC, 5 CO 2. y se pasaron dos veces a la semana. Las células dentro de 20 pases fueron utilizados en el estudio actual. La viabilidad celular La viabilidad celular de ensayo se analizó con un ensayo de tetrazolio modificado usando el reactivo MTS siguiendo el protocolo de los fabricantes 15. En las células breves, A2780 se colocaron en placas en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos (7.510 células por pocillo 3) en 100 l de medio, que asegurado una confluencia 4060 células después de 24 horas de crecimiento. A continuación, el medio se reemplazó con 100 l de medio fresco que contiene cloroquina y ZnCl 2 a diversas concentraciones, y se cultivaron las células durante los períodos designados. A cada pocillo, se añadieron 20 l de la solución de MTS, y las células se incubaron a 37ºC durante 1 hora para permitir el desarrollo del color. La absorbancia se registró a 490 nm y los datos se expresaron como un porcentaje de los valores obtenidos a partir de las células de control no tratadas. Detección de zinc intracelular detección de los lisosomas y los iones libres de zinc intracelular se realizó utilizando el LysoTracker, y FluoZin-3 sondas bajo microscopía de fluorescencia siguiendo las instrucciones del fabricante 20. A2780 células se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad de 310 células por pocillo 5 . Veinticuatro horas después de la siembra, las células se trataron con cloroquina y ZnCl 2 a las concentraciones indicadas durante 30 min. Después del tratamiento el medio se reemplazó con medio fresco (RPMI 1640) que contiene 50 nM LysoTracker y / o 1 M FluoZin-3. Después de incubar durante otros 30 min, se retiró el medio y las células se lavaron tres veces con (solución de sal de Hanks equilibrada) HBSS y visto en un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U. Zinc se detectó como una (excitación FluoZin-03 a. m. 490/20 nm y de emisión de 528/38 nm) Color verde y lisosomas como un color rojo (LysoTracker excitación 555/28 nm y de emisión de 617/73 nm). Co-localización de iones de zinc y lisosomas se determinó mediante la fusión de las imágenes verde y rojo. Las intensidades de fluorescencia se cuantificaron utilizando el software NIS-Elements AR (Nikon Instruments). mediciones celular a nivel de zinc Una forma sensible y específica del indicador de zinc fluorescente de alta afinidad se utilizó FluoZin-3 para determinar los niveles de iones de zinc celular 20. La sonda FluoZin-3 se preparó inicialmente en DMSO (mM 5) y más diluido en el medio de cultivo antes de la adición a las células. A2780 (110 4 células por pocillo) se sembraron en una placa de 96 pocillos. Veinticuatro horas después de la siembra, las células se trataron con cloroquina durante 1 hora en presencia de ZnCl 2 a las concentraciones indicadas. Se añadió FluoZin-3 (1 M, concentración final) y se incubaron las células durante otros 30 min a 37ºC (concentración de DMSO en el medio fue inferior a 0,5). Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con medio fresco para eliminar cualquier colorante no específica asociada con la superficie celular. se añadió medio adicional y se incubaron las células durante otros 30 min antes de que se hicieron las mediciones de fluorescencia. La fluorescencia se midió a 485/535 nm (excitación / emisión), usando un Wallac 1420 Multilabel contador (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA). El análisis de transferencia Western Western blot se realizó como se describe 20. 21. En resumen, las células se lisaron con un tampón que contiene Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 50 mM, 0,5 NP40, NaF 50 mM, 1 mM Na 3 VO 4. 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 25 g / ml de leupeptina, y 25 g / ml de aprotinina. El lisado se sometió a ultrasonidos en hielo durante 6 golpes de 10 segundos cada uno y se centrifugó a 15.000 g durante 15 min. Se recogieron los sobrenadantes para eliminar el material insoluble. Treinta a cuarenta microgramos de proteína de cada muestra fueron separados en un gel de 12 SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF, y se transfirieron con anticuerpos contra la caspasa-3, PARP, LC3B-II o actina. Análisis estadístico Todos los análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism (San Diego, CA). ANOVA de una vía con el análisis de Bonferroni se utilizó para determinar las diferencias entre los grupos de control y experimentales, con P0.01 como el nivel de significación estadística. El IC 50 de la cloroquina, en presencia o ausencia de ZnCl 2. sobre la viabilidad celular se calculó con una curva de regresión no lineal (ecuación dosis-respuesta sigmoidal). Resultados La cloroquina aumenta la absorción de zinc en las células A2780 Para comprender si la cloroquina (Figura 1) afecta a la absorción de zinc, las células A2780 fueron tratados con 100.300 M cloroquina en presencia de concentraciones crecientes de cloruro de zinc durante 1 hora. los niveles de zinc basales intracelulares eran apenas detectable en las células control como ensayó usando la sonda FluoZin-3 y un lector de placas fluorescente, como hemos descrito anteriormente 15. 17. La adición de cloruro de zinc sólo ligeramente aumento de los niveles intracelulares de zinc lo que sugiere que la internalización de los iones de zinc es en gran parte limitado por la estructura de la membrana celular. Sin embargo, cuando se añadió cloroquina a los niveles intracelulares de zinc medio de cultivo se mejoraron de manera espectacular (Figura 2A), indicando que la cloroquina actúa como un ionóforo de zinc. Esta mejora de los niveles intracelulares de zinc por cloroquina era claramente dependiente de la cantidad de cloruro de zinc y la cloroquina añadido (Figura 2A). examen microscópico fluorescente demostró, además, que la absorción de zinc se mejora significativamente por la cloroquina en este sistema modelo de células (Figura 2B). Para determinar la especificidad de la detección intracelular de zinc, TPEN, una permeable alta afinidad compuesto de unión a metal de la membrana establecido 22. 23. Se añadió a las células antes de la adición de zinc y cloroquina. Como se muestra en la Figura 3A. el pretratamiento con TPEN atenuó significativamente la acumulación intracelular de zinc cloroquina inducida, lo que indica que la cloroquina trae específicamente zinc en las células. Esto se confirmó adicionalmente mediante la adición de cloruro de hierro o cloruro de cobre, que no afecta a la mejora cloroquina inducida de los niveles intracelulares de zinc (Figura 3B). Para estar seguro de que la cloroquina no moviliza los iones de zinc a partir de moléculas de unión intracelular de zinc, pretratados las células con Ca-EDTA, una membrana celular quelante de metales impermeable, antes de la adición de la cloroquina. Como se muestra en la Figura 3A. en presencia de Ca-EDTA cloroquina no mejoró la señalización intracelular de zinc, más el apoyo a la conclusión de que la cloroquina es un ionóforo de zinc. Expandir la Figura 1. La estructura química del compuesto cloroquina. sal de cloroquina difosfato se adquirió de Sigma-Aldrich (San Louis, MO, C6628). Más Expandir Figura 2. Efectos de la cloroquina sobre la absorción de iones de zinc. A . células A2780 se sembraron en una placa de 96 pocillos y se trataron con cloroquina (CHQ) solo o en combinación con ZnCl 2 a las concentraciones indicadas durante 1 hora. Se añadió la sonda FluoZin-3 (1 M) y la señal fluorescente se midió mediante excitación a 490/20 nm y emisión a 528/38 nm. De datos (n 3, bares, SEM) se presentan como un porcentaje del nivel de fluorescencia más alto detectado. , P0.01, en comparación con las células sin tratamiento CHQ, utilizando ANOVA de una vía seguida por el análisis de Bonferroni. B. células A2780 se sembraron en una placa de 12 pocillos y se trataron con CHQ y ZnCl 2 a las concentraciones indicadas durante 1 hora. Después de la adición de la sonda FluoZin-3, se examinaron las células bajo un microscopio de fluorescencia por excitación a 490/20 nm y emisión a 528/38 nm. Se muestra son imágenes representativas de tres experimentos individuales. Más Expandir Figura 3. Efectos de CuCl2. FeCl2. TPEN y Ca-EDTA sobre la absorción de iones de zinc inducido por cloroquina. A . células A2780 se sembraron en una placa de 96 pocillos y se trataron previamente con TPEN o Ca-EDTA durante 15 min antes de la adición de cloroquina (CHQ) y ZnCl 2 a las concentraciones indicadas durante 1 hora. B. células A2780 se sembraron en una placa de 96 pocillos y se trataron con CHQ solo o en combinación con ZnCl 2. CuCl 2. o FeCl 2 a las concentraciones indicadas durante 1 hora. Después se añadió el FluoZin-3 de AM (1 M) de la sonda y la señal fluorescente se registró mediante excitación a 490/20 nm y emisión a 528/38 nm. De datos (n 3, bares, SEM) se presentan como un porcentaje del nivel de fluorescencia más alto detectado. , P0.01, en comparación con la fluorescencia detectada en las células sin tratamiento CHQ, utilizando ANOVA de una vía seguido por el análisis de Bonferroni. cloroquina objetivos de zinc a los lisosomas en nuestro estudio anterior, hemos demostrado que los ionóforos de metal, como clioquinol, llevar iones de zinc en los lisosomas de las células cancerosas conducen a la apoptosis mediada por lisosoma 15. Debido a la cloroquina es un lisosomal establecida agente de 12. 13 focalización. 24. examinamos la distribución intracelular de zinc después del tratamiento de las células A2780 con cloroquina y zinc. Como se muestra en la Figura 4. acumulación inducida por cloroquina de iones intracelulares de zinc principalmente en los lisosomas, como se evidencia por la co-localización de las señales fluorescentes de FluoZin-3 y LysoTracker. Clioquinol, un ionóforo zinc establecido que se dirige a los lisosomas zinc 15. Se utilizó como control positivo (Figura 4B). Por lo tanto, la cloroquina es un ionóforo de zinc que se dirige a los lisosomas celulares zinc. Expandir Figura 4. Distribución de iones de zinc intracelular en las células A2780 después del tratamiento con cloroquina. A . A2780 células se sembraron en una placa de 6 pocillos y se trataron con cloroquina (CHQ) y ZnCl2 a las concentraciones indicadas durante 1 hora. Después de la adición de las sondas FluoZin-3 y LysoTracker, las células fueron examinadas por microscopía confocal (excitación, 490/20 nm, emisión, 528/38 nm para FluoZin-3 555/28 nm, 617/73 nm para LysoTracker, respectivamente) . Se muestra son imágenes representativas de tres experimentos individuales. B. células A2780 se sembraron en una placa de 12 pocillos y se trataron con clioquinol (CQ) y ZnCl 2 a las concentraciones indicadas durante 1 hora. Confocal imágenes fueron capturadas como anteriormente hemos descrito 17. Los iones de cinc mejoran chloroquines citotoxicidad Para determinar si la adición de zinc y la cloroquina puede matar a las células cancerosas de manera más eficaz, las células A2780 se trataron con concentraciones crecientes de cloroquina en presencia de cloruro de zinc 25 M durante 72 horas. análisis de viabilidad de las células indicó que los iones de zinc mejora de forma significativa chloroquines citotoxicidad en este modelo de sistema (Figura 5A). El IC 50 de la cloroquina, que es típicamente alrededor de 22.310 M en las células A2780, se redujo a 1,019 M en presencia de cloruro de 25 M zinc. Además, la combinación de cloroquina y el tratamiento de zinc mejora de forma significativa la muerte celular apoptótica como se evidencia por la caspasa-3 de activación y escisión de PARP (Figura 5B). Los iones de cinc también mejoraron chloroquines actividad inhibidora de la autofagia, como se indica por la detección LC3B-II (Figura 5B). Expandir la Figura 5. Efectos de cloroquina más de zinc sobre la activación de caspasa 3 y la expresión LC3B-II. A2780 células fueron tratadas con cloroquina (CHQ) o ZnCl2. solos o en combinación a las concentraciones indicadas. Los lisados ​​celulares se prepararon y Western blot se realizó utilizando anticuerpos primarios contra la pro-caspasa 3, LC3B-II, PARP, y actina. Se demuestran los borrones representativos de tres experimentos individuales. Discusión El principal hallazgo de este estudio es que la cloroquina es un ionóforo de zinc, lo que contribuye a nuestra comprensión de chloroquines actividad biológica en células cancerosas humanas. Mientras que la cloroquina se ha estudiado en la investigación biomédica 12. 13 y se utiliza para el tratamiento de la malaria 1 y otras enfermedades humanas 25. 26. Esta actividad del compuesto no se ha informado anteriormente. La conclusión de que la cloroquina es un ionóforo de zinc se basa en la detección de niveles significativamente elevados intracelulares de zinc cuando ambos zinc y cloroquina se añadieron al medio de cultivo celular. La sonda fluorescente de zinc utilizado en este estudio es un marcador intracelular bien establecido para los iones de zinc y ha sido validado en estudios previos para la detección específica de zinc 15. 27. 28. En el estudio actual, la especificidad de la detección de zinc se confirmó por el uso de TPEN, un compuesto que bloqueó 22. absorción de zinc cloroquina inducida por unión de alta afinidad de metal. Además, en presencia de Ca-EDTA, una membrana impermeable quelante de metales, la cloroquina no aumentó los niveles intracelulares de zinc, lo que indica que trae específicamente zinc extracelular en las células para aumentar los niveles intracelulares de zinc. Curiosamente, la adición de iones de hierro o de cobre no afectó la absorción de zinc cloroquina inducida, lo que indica además que la cloroquina puede actuar principalmente como un ionóforo de zinc. La afinidad de un compuesto de unión de metal para metales diferentes puede diferir drásticamente 29. Por lo tanto, si la cloroquina también actúa como queda por determinar un ionóforo para otros iones metálicos tales como cobre y hierro. Las concentraciones molares de los metales utilizados en este estudio se basaron en nuestros informes anteriores 15. 23. Mientras que la afinidad de unión de la cloroquina para diversos iones metálicos debe definirse aún más, la actividad de ionóforo de zinc de este compuesto proporciona una nueva comprensión de cómo la cloroquina, en presencia de zinc, puede ejercer sus efectos contra el cáncer. Hemos informado anteriormente de que el metal compuestos, tales como clioquinol de unión, el objetivo de zinc a los lisosomas induciendo de ese modo la apoptosis 15. El mismo parece ser cierto para la cloroquina, como se evidencia por la co-localización de zinc con el lisosoma y la inducción de apoptosis cuando las células eran tratados con la combinación de cloroquina y zinc. Estos datos sugieren que clioquinol y la cloroquina puede en parte comparten un mecanismo similar en su acción contra el cáncer. Ambos compuestos se utilizan actualmente en los seres humanos para otras indicaciones 25. 26. 30 y han demostrado actividad contra el cáncer en sistemas de modelos experimentales 6 8. 20. El hecho de que la cloroquina actúa como un ionóforo de zinc también apoya nuestra reivindicación reciente que ionóforos de metal son una nueva grupo de compuestos contra el cáncer, que merecen una mayor exploración 17. Es interesante observar que la combinación de cloroquina y zinc altera los niveles de proteína LC3B-II en nuestro modelo de sistema, lo que indica que el zinc afecta chloroquines efecto inhibidor sobre la autofagia. El hecho de que el zinc también potencia la apoptosis inducida por la cloroquina en las células A2780 sugiere que la inhibición de la autofagia y la inducción de apoptosis por la cloroquina es probable un evento secuencial en este sistema modelo. Esto es consistente con la observación de que la inhibición de la autofagia celular conduce a resultados pro-apoptóticas en células de cáncer humano 31. En conclusión, hemos identificado la cloroquina como un ionóforo de zinc, lo que revela una nueva visión de la actividad chloroquines contra el cáncer. Dado que tanto la cloroquina y zinc se consideran agentes anticancerígenos potenciales, la combinación de los dos puede ser una nueva estrategia para desarrollar enfoques más eficaces en el tratamiento del cáncer. Contribuciones de los autores concebido y diseñado los experimentos: JX AM wqd. Realizado los experimentos: JX AM BNH BP. Analizados los datos: JX AM BNH JW wqd. Contribuido reactivos / materiales / herramientas de análisis: JW wqd. Escribió el documento: JX BNH wqd. Referencias 1. Kraft K, E Hempelmann, Skorska-Stania A (2012) De azul de metileno a la cloroquina: una breve revisión del desarrollo de una terapia contra la malaria. Parasitol Res 111: 16. 2. 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